En Alemania están a disposición del público en farmacias, supermercados y otras grandes superficies comerciales

Los test para detectar el virus son una herramienta esencial en una situación de emergencia sanitaria, para controlar la COVID-19. Cada tipo de test tiene su función y utilidad. ¿Por qué los test de antígenos se están vendiendo ya en los supermercados de Alemania y aquí todavía ni siquiera están en las farmacias?

¿Cómo funciona un test de antígenos?

Este tipo de test confirman la presencia del virus al detectar sus proteínas o antígenos. Hay distintas técnicas o soportes, pero en definitiva más o menos todos tienen el mismo fundamento. En este ejemplo concreto explicamos cómo funciona un test cromatográfico. Se toma una muestra de la nariz con un bastoncillo o de la saliva, se añaden unas gotas de un reactivo que extrae las proteínas del virus, se mezcla bien durante uno o dos minutos. Con una pequeña pipeta de plástico se colocan dos o tres gotas de la muestra en la ventana “S” (sample) del dispositivo, y se esperan 15 minutos.

En la ventana “S” hay una pequeña esponja que se empapará con la muestra y los reactivos. La mezcla se moverá por capilaridad por la tira de papel. Ahí también hay dos componentes esenciales: una proteína marcada con látex poliéster de color verde que utilizaremos como control para comprobar que el sistema funciona bien, y un anticuerpo monoclonal contra la glicoproteína de la superficie de la envoltura del virus (la proteína S, spike), marcada en este caso con látex poliéster de color rojo.

En otra zona del dispositivo hay otra ventana con las letras “C” (control) y “T” (test). Ojo, la “C” es de control, ¡no de coronavirus! A esa altura del dispositivo, en “C” hay anticuerpos que se unirán específicamente con la proteína control, de forma que esta será capturada por los anticuerpos y quedará fija a ese nivel, dando lugar a una reacción anticuerpo-proteína que se manifestará como una línea de color verde (recuerda que en la proteína iban adheridas unas pequeñísimas bolitas de látex verde).  La aparición de una línea verde a nivel de la “C” significa por tanto que el control ha salido bien, que los reactivos del test han funcionado correctamente.

Por otra parte, en la zona del dispositivo donde aparece la “T” hay anticuerpos específicos contra la proteína S del virus. Si en la muestra había partículas virales, éstas se habrán unido a los anticuerpos marcados con látex poliéster de color rojo. Este complejo proteína del virus-anticuerpo marcado, se moverán por capilaridad hasta encontrarse con el otro anticuerpo contra la proteína del virus a nivel de la “T”. Se formará así un complejo tipo sándwich anticuerpo-antígeno-anticuerpo marcado, que dará lugar a una línea de color rojo a nivel de “T”.  Si en la muestra no había virus, no se dará toda esta reacción y no aparecerá ninguna banda a nivel de la “T”.

En conclusión, los resultados que podemos obtener son: 

– No aparece ninguna banda, ni en “C” ni en “T”: el control no ha funciona bien, luego el test es INVÁLIDO, no podemos concluir ningún resultado, ni negativo ni positivo.

– Banda de color verde en “C” y nada en “T”: el control funciona bien y no se detectan antígenos del virus, resultado NEGATIVO.

– Banda de color verde en “C” y banda de color rojo en “T”: el control funciona bien y se han detectado antígenos del virus, resultado POSITIVO.

– No aparece la banda de color verde en “C”, pero sí aparece la banda de color rojo en “T”: el control no ha funciona bien, luego el test también es INVÁLIDO, tampoco podemos concluir ningún resultado, ni negativo ni positivo, aunque haya salido la banda de color rojo en “T”. 

¿Por qué puede salir un resultado INVÁLIDO? Muy probablemente por un problema en los reactivos o mala práctica. Si no aparece la banda de color verde en el control, el test es inválido y no podemos sacar ninguna conclusión, independientemente de lo que salga en “T”. 

Si me ha salido NEGATIVO, ¿quiere decir que no estoy infectado? No. En la mayoría de los casos, desde que comienza la infección, hay unos días (cuatro o cinco) en los que la cantidad de virus en la muestra puede ser muy pequeña e insuficiente para que los detecte el test de antígenos. El límite de detección de antígenos es mayor que el límite de detección del ARN mediante PCR: hace falta una mayor carga viral para que el test de antígenos detecte al virus. Por lo tanto, el test de antígenos puede salir negativo, pero tú puedas estar infectado, en los primeros días de la infección e incluso ser contagioso. Un test negativo no es garantía de no estar contagiado y de no poder contagiar a otros. Si tienes dudas lo mejor sería repetir el test.

Si me ha salido POSITIVO, ¿qué significa y qué debería hacer? Significa, con una muy alta probabilidad, que estás contagiado con el virus. Tu carga viral es lo suficientemente alta como para que la detecte el test, por lo que además estarás en la fase más contagiosa, puedes transmitir la enfermedad con mucha facilidad aunque no presentes síntomas. Deberías aislarte inmediatamente, avisar a tu centro de salud para que te confirmen el resultado mediante una PCR (un test mucho más sensible) y avisar a tus contactos.

Como acabamos de ver las ventajas del test de antígenos es su rapidez y sencillez, no requiere reactivos caros, ni máquinas ni personal técnico altamente cualificado. Son mucho más baratos que la PCR. Los puedes hacer tu solito en casa. Sin embargo, los test rápidos de antígenos han sido motivo de cierta controversia por su baja sensibilidad comparada con la PCR. Sin embargo, cada vez hay más datos que demuestran su enorme potencial para controlar la pandemia.

¿Por qué pueden ser muy útiles para controlar la pandemia?

La detección del SARS-CoV-2 es fundamental para el control de la enfermedad y se ha basado, principalmente, en la RT-PCR cuantitativa (reacción en cadena de la polimerasa, con transcriptasa inversa). Esta PCR detecta el genoma del virus a partir de muestras nasales o de la farínge y lo amplifica en 30 a 40 ciclos, lo que permite detectar incluso un número mínimo de copias del ARN del virus. La PCR es una prueba clínica muy potente, sobre todo cuando un paciente está o fue recientemente infectado con el SARS-CoV-2. Los fragmentos de ARN del virus pueden permanecer durante semanas después de que se haya eliminado el virus infeccioso, a menudo en personas sin síntomas. 

(Fuente: @Guillermo4ldama)

Sin embargo, para las medidas de salud pública, se necesita otro enfoque. El objetivo no es saber si alguien tiene ARN del virus en la nariz, quizá de una infección anterior, sino si es infeccioso en este momento concreto. La mayoría de las personas infectadas con SARS-CoV-2 son contagiosas durante 4 a 8 días. Por lo general, las muestras no contienen virus potencialmente contagiosos (cultivo positivo) más allá del día 9 después de la aparición de los síntomas, y la mayor parte de la transmisión ocurre antes del día 5. Este momento se ajusta a los patrones observados de transmisión del virus (generalmente de dos días antes a 5-7 días después del inicio de los síntomas), de ahí viene la recomendación de los 10 días de aislamiento. Esa ventana de transmisibilidad contrasta con una media de 22–33 días en los que la PCR puede ser positiva (más tiempo con infecciones graves y algo más corto entre individuos asintomáticos). Esto sugiere que 50-75% de las veces que un individuo es positivo por PCR, es probable que sea post-infeccioso (se detectan restos del ARN del virus pero el virus no está activo).

La PCR amplifica, el test de antígenos no

Una vez que el sistema inmunológico ha controlado la replicación del SARS-CoV-2, los niveles de ARN detectables por PCR en las secreciones respiratorias caen a niveles muy bajos cuando los individuos tienen muchas menos probabilidades de infectar a otros. Las copias de ARN restantes pueden tardar semanas, incluso ocasionalmente meses, para desaparecer, tiempo durante el cual la PCR permanece positiva. Lógicamente, es esperable que una prueba como la de antígenos que detecta a alguien que pueda ser contagioso tenga una sensibilidad del 30-40% en comparación con la PCR, cuando se analiza una muestra aleatoria de personas asintomáticas.

Aunque los test de antígenos tienen una menor sensibilidad analítica que la PCR (requieren más cantidad de virus para que den positivo), su habilidad para detectar individuos con alta carga viral y por tanto contagiosos es tan alta como la PCR. Su especificidad (la capacidad de identificar correctamente los que no están infectados), es comparable a la PCR. 

(Fuente: @michaelmina_lab)

En esta imagen se resume un trabajo en el que se compara el resultado del test de antígenos, la PCR (el valor de Ct o ciclo en el que sale positivo) y el cultivo, que permite detectar la viabilidad del virus, en personas asintomáticas. Demuestra que el test de antígenos es capaz de detectar el 100% de las muestras PCR positivas con cultivo positivo, las que mayor carga viral tienen (Ct más bajo) y más contagiosas son (porque el virus está activo: son cultivo positivo).

Por lo tanto, si lo que quieres es identificar a un paciente que está infectado por el virus, para establecer si está enfermo o no en personas con o sin síntomas, necesitas una prueba muy sensible (que no de falsos negativos) y especifica (que no de falsos positivos). En este caso la prueba de elección sería la PCR, sin duda.

Pero si lo que buscas es detectar rápidamente a las personas más contagiosas (con o son síntomas) para evitar transmisiones, la PCR (una prueba cara y que tarda una media de 24-48 h) quizá no sea la mejor opción. En este caso el objetivo no es diagnosticar la enfermedad, sino detectar a los más contagiosos, los que tienen más virus. Para esto, el test de antígenos es la solución. Sí, es menos sensible que la PCR, pero su baja sensibilidad se compensa con la frecuencia de uso, por ser rápido, sencillo y barato. Además, recientemente se ha confirmado que la detección de SARS-CoV-2 en saliva tiene una alta tasa de concordancia con la de las muestras nasofaríngeas, y lo que es más importante que sólo el 2% de los individuos llevan el 90% de los viriones que circulan dentro de las comunidades (super-portadores y posiblemente también super-contagiadores), por eso es tan importante detectarlos a tiempo.

¿Qué es mejor un test con una sensibilidad del 100% como la PCR o un test de antígenos con una sensibilidad menor pero mucho más rápido y que puedo repetir frecuentemente?

Para detectar los contagiosos, un test rápido y frecuente

Además de los test de antígenos, hay ya otro tipo de tecnologías que permiten desarrollar test rápidos que se podrían hacerse de uso doméstico. Por ejemplo, la denominada amplificación isotérmica (LAMP, del inglés, loop-mediated isothermal amplification) está basada en técnicas moleculares y, a diferencia de la PCR, requiere sólo de una temperatura constante para la reacción de amplificación e identificación de un fragmento del material génico del virus. Este test es mucho más rápido que la PCR (menos de 30 minutos). Es también una técnica muy sensible. Ya hay varias compañías que comercializan esta tecnología en forma de kits portátiles. Desde Noviembre de 2020 la FDA aprobó el primer autotest para uso domiciliario basado en esta técnica, denominado Lucira, aunque todavía no está disponible comercialmente y se necesitará receta médica para su uso.

Vacunar, vacunar, vacunar y … test, test, test

Ya se venden en Farmacias test de embarazo, de ovulación, auto-test de VIH, y tiras reactivas para detección de nivel de glucosa (sin receta); test de anticuerpos Covid, test para celiacos, tiras infección orina (con receta), y auto-inyectables de insulina, heparina y glucagón (con receta). No solo las vacunas, sino también los test de antígenos domésticos para SARS-CoV-2 podrían cambiar el rumbo de la pandemia. 

Es cuestión de tiempo, pero acabaran en el mercado. Mi apuesta es inundar el mercado con auto-test de antígenos, hacer muchos y muy frecuentemente. Que se vendan en cualquier lugar, como ya ocurre en otros países, y que los podamos hacer de manera frecuente, varios a la semana para monitorizar el acceso a colegios, universitarios, centros sanitarios, lugares de ocio, reuniones, residencias, …. Si sale negativo, como ya hemos dicho, no quiere decir que no puedas contagiar. Pero si sale positivo, aislamiento inmediato.

También te puede interesar:

– Los test de antígenos

– Test, test, test: los tres test del coronavirus

Puedes consultar:

Clarifying the evidence on SARS-CoV-2 antigen rapid tests in public health responses to COVID-19. Mina, MJ,. y col. The Lancet. February 17, 2021.

Diagnostics for SARS-CoV-2 infections. Kevadiya, BD., y col. Nature Materials, February 15, 2021.

Comparison of Saliva and Nasopharyngeal Swab Nucleic Acid Amplification Testing for Detection of SARS-CoV-2. A Systematic Review and Meta-analysis. Butler-Laporte, G., y col. JAMA Intern Med. 2021;181(3):353-360.

NOTA (7/4/2021): La FDA ya autorizó al menos tres tipos de test de antígenos. En Alemania ya se venden en los supermercados, lo mismos en Portugal (sin IVA, por cierto). En Francia, Bélgica, Austria y Suiza se vende en farmacias sin receta. Reino Unido va a distribuir dos por semana gratis. El precio de un test en un laboratorio privado puede superar los 30 euros. En otros países se comercializan a 4-5 euros el test (aproximadamente).

Lista de test rápidos de antígenos evaluados por la Unión Europea

Los test que permiten diagnosticar la infección son los basados en la PCR y en antígenos, porque detectan directamente el virus (el genoma o sus proteínas). Evidentemente que estos test den positivo no implica siempre que el virus esté activo y sea infectivo: podemos detectar su genoma o sus proteínas pero que el virus no esté completo y estemos detectando “restos” del virus. Por otra parte, los test de anticuerpos detectan moléculas producidas por tu cuerpo cuando estás infectado, son por tanto test para evaluar la enfermedad. Que des positivo en cualquiera de estos test no significa siempre que seas infeccioso o que tengas la enfermedad activa. El diagnóstico de una enfermedad no se basa solo en un test microbiológico sino que tiene en cuenta otros aspectos clínicos, los síntomas, otras analíticas. Los test microbiológicos ayudan el médico a diagnosticar una enfermedad.

Recordemos que los test de antígenos confirman la presencia del virus al detectar sus proteínas o antígenos. Hay distintas técnicas o soportes sobre los que hacer este tipo de test, pero en definitiva más o menos todos tienen el mismo fundamento. Sobre un soporte se fijan anticuerpos específicos que reaccionarán contra alguna proteína del virus. Se suele emplear la proteína de la superficie de la envoltura (la proteína S), que se proyecta hacia el exterior. Si en la muestra hay partículas virales, éstas quedarán fijadas al anticuerpo. Es como si el virus o sus proteínas hubieran sido capturados por el anticuerpo. A continuación, se añade un segundo anticuerpo contra el virus de manera que se forme un emparedado o “sándwich”: anticuerpo-virus-anticuerpo. Este segundo anticuerpo estará marcado o señalado de alguna manera para poner de manifiesto la reacción. Si la reacción es positiva, demuestra que había proteínas del virus, es decir que la persona estaba infectada.

Las ventajas de este tipo de test es su rapidez y sencillez, no requiere reactivos caros, ni máquinas ni personal técnico altamente cualificado. Son mucho más baratos que la PCR. Suelen estar manufacturados como un test de embarazo: se toma una muestra de la nariz con un bastoncillo o de la saliva, se añaden unas gotas de un reactivo que extrae los antígenos del virus, se coloca en el dispositivo, y se esperan menos de 30 minutos a que aparezcan las bandas reactivas correspondientes.

Su especificidad (la probabilidad de que una persona sana de resultado negativo) es similar a la de la PCR. Esto quiere decir que el número de falsos positivos es bajo. Pero su sensibilidad (la probabilidad de que un infectado de resultado positivo) es menor que la PCR. Esto significa que pueden dar más falsos negativos que la PCR. La PCR es mucho más sensible que la detección de antígenos: mientras que mediante la PCR (una técnica que lleva consigo una amplificación) podemos llegar a detectar una molécula de RNA viral por microlitro, con los test de antígenos necesitamos miles o decenas de miles de proteínas del virus por microlitro para que el resultado sea positivo. Entonces, ¿por qué decimos que este tipo de test pueden ser una buena herramienta para el diagnóstico?

Al tener una sensibilidad menor que la PCR, los test de antígenos son positivos a concentraciones más altas del virus y eso puede tener su ventaja. Aunque no sabemos exactamente qué carga viral implica que uno es infeccioso o deja de serlo, podemos asumir que cuanto mayor sea la carga viral, mayor probabilidad de que uno sea contagioso. 

(Fuente: referencia 1)

Los test de antígenos pueden resultar muy útiles al principio de la infección, cuando la carga viral es más alta: unos días antes de aparecer los síntomas y una semana después. El problema de la PCR es que es tan sensible que puede seguir siendo positiva varias semanas después de la aparición de los síntomas, por detectar incluso restos del genoma viral no activo, no infeccioso. Los test de antígenos podemos hacerlos con mucha mayor frecuencia: es mejor un test (barato y sencillo) que puedes hacer dos veces por semana, por ejemplo, que otro (más caro y complejo como la PCR) que haces cada dos semanas. 

(Fuente: referencia 2)

El estado de la infección o la enfermedad se debe siempre correlacionar con el historial clínico y con otra información diagnóstica. La interpretación de un test siempre hay que hacerla dentro de un contexto clínico. Por ejemplo, si el test de antígenos sale negativo pero la persona tiene algún síntoma, se podría combinar con la PCR, mucho más sensible. Los test de antígenos pueden ser una herramienta muy útil en atención primaria. Como pueden repetirse con mucha más facilidad que las PCR pueden ser una buena alternativa para monitorizar y hacer un seguimiento en determinados grupos o colectivos: residencia de ancianos, centros sanitarios, colegios, … Lo que no tengo tan claro es si estos test son útiles para un cribado masivo de asintomáticos.

NOTA: otro tema a tener en cuenta es que existen varias empresas que comercializan test de antígenos y que, aunque el fundamento sea similar, los resultados no tienen que ser exactamente iguales. Los test pueden variar en el tipo de anticuerpos que se empleen, la proteína del virus que detectan o el modo de revelar la reacción: no todos son iguales. La sensibilidad y especificidad pueden ser diferente entre ellos y deberían antes evaluarse. Recordemos el fiasco de los famosos test rápidos chinos que resultaron ser un cuento chino.

(1) SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 and MERS-CoV viral load dynamics, duration of viral shedding and infectiousness: a living systematic review and meta-analysis. Cevik, M., y col. doi:https://doi.org/10.1101/2020.07.25.20162107 (Preprint)

(2) Fast coronavirus tests: what they can and can’t do. Guglielmi, G. 16 September 2020. Nature.

Cómo funcionan y para qué sirven los test de diagnóstico del coronavirus: sensibilidad, especificidad, falsos positivos, falsos negativos

Lo dijo la OMS ya hace unas semanas: test, test, test

Durante una infección, el virus se multiplica activamente. Cuando comienza, el virus se puede detectar en muestras biológicas (frotis faríngeo o nasofaríngeo, aspirado traqueal o lavado broncoalveolar). Primero hay un período de latencia en el que todavía no es posible detectar la respuesta de tu sistema inmune. Pero después de unos días, comienzas a producir anticuerpos. Se producen primero anticuerpos del tipo IgM hasta alcanzar un máximo a los 7-10 días para, más tarde, casi desaparecer. Esta respuesta primaria es indicativa de una infección aguda. Posteriormente se producirá la respuesta inmune secundaria, más rápida, intensa y prolongada. Se producirán anticuerpos de tipo IgG y durarán más tiempo en la sangre. Además, a nivel de las secreciones mucosas, como las respiratorias, juega un papel predominante la IgA.

Para detectar la presencia del virus (detección directa) podemos emplear dos tipos de test: la PCR que detecta el genoma del virus o los test inmunológicos que detectan las proteínas (antígenos) del virus. El tercer tipo de test es el que detecta los anticuerpos que produces como respuesta a la infección, son los test serológicos de detección indirecta del virus. Aunque hay varias modalidades de cada uno de estos tipos de test, vamos a explicar brevemente cómo funcionan.

Detectar el genoma del virus: la RT-PCR

El genoma del coronavirus SARSCov2 es una molécula de ARN monocadena de unos 30 kilobases. Una vez tomada la muestra (el frotis nasofaríngeo o aspirado más profundo), lo primero que hay que hacer es extraer el genoma del virus. Esto normalmente se hace mediante un kit de extracción de ácidos nucleicos. Así, además de inactivar el virus, obtenemos su genoma ARN. A continuación, hay que copiar ese ARN en forma de ADN. Eso se hace con otro kit que emplea una enzima que se denomina transcriptasa inversa o Retro Transcriptasa (de ahí el “RT”, del nombre RT-PCR). Luego, el genoma del virus en forma de ADN se amplifica mediante la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR, en inglés. Ojo, aquí PCR no significa “proteína C reactiva”). Esta amplificación consiste en hacer millones de copias de un fragmento del ADN, de forma que podamos “visualizarlo” o detectarlo mediante un sistema concreto. El sistema de PCR a tiempo real permite incluso cuantificar la muestra, es decir, saber cuántas copias del virus tenemos por mL. 

Si la reacción es positiva, demuestra que había ARN del virus, es decir que la persona estaba infectada.

Como lo primero que obtuvimos del virus fue su genoma, este tipo de pruebas son las primeras que se desarrollaron. De hecho desde el 13 de enero, la OMS ya publicó el primer protocolo. Normalmente, se suelen realizar dos ensayos: uno de cribado o screening y un segundo confirmatorio. Incluso se puede hacer un tercero adicional de confirmación. Estos tres ensayos de RT-PCR se diseñan para detectar tres genes distintos del virus.

Estos test de PCR son muy específicos y sensibles. Suelen tardar en realizarse unas cuantas horas. Requieren un equipamiento y un personal técnico especializado. Pueden dar resultado positivo en personas antes de que manifiesten síntomas, pero que ya tengan el virus. A lo largo de la enfermedad pueden permitir hacer un seguimiento de cómo va la infección, porque cuando la persona ya se ha curado y no tiene el virus activo, en principio debería dar negativo. No se puede descartar que pacientes convalecientes “sin síntomas” puedan dar positivo en la RT-PCR y seguir siendo portadores del virus.

Detectar las proteínas del virus: test antigénicos

Otra forma de confirmar la presencia del virus es detectar sus proteínas o antígenos. Hay distintas técnicas o soportes sobre los que hacer este tipo de test, pero en definitiva más o menos todos tienen el mismo fundamento. Sobre un soporte se fijan anticuerpos específicos que reaccionarán contra alguna proteína del virus. En este caso es contra las proteínas de la superficie de la envoltura (proteína S), las que se proyectan hacia el exterior y forman esas espículas que dan el nombre a este tipo de virus, corona-virus. Si en la muestra (las mismas que para la RT-PCR) hay partículas virales, éstas quedarán fijadas al anticuerpo. Es como si el virus hubiera sido capturado por el anticuerpo. A continuación, se añade un segundo anticuerpo contra el virus de manera que se forme un emparedado o “sándwich”: anticuerpo-virus-anticuerpo. Este segundo anticuerpo estará marcado o señalado de alguna manera para poner de manifiesto la reacción. 

Si la reacción es positiva, demuestra que había proteínas del virus, es decir que la persona estaba infectada.

Este tipo de test basado en la detección de moléculas es muy habitual en diagnóstico clínico. Su fundamento es el mismo que las tradicionales pruebas de detección de drogas o los test de embarazo. En el caso que nos ocupa, tardó en aparecer en escena porque se requiere el empleo de anticuerpos de captura específicos frente a este virus concreto. La ventaja es que son mucho más rápidos, y según el tipo de soporte, se pueden realizar en unos pocos minutos. No necesitan un equipamiento especifico ni un personal técnico altamente cualificado. Son más baratos. La desventaja es que son mucho menos específicos y sensibles que la RT-PCR.

Un comentario adicional a ambos test de detección directa del genoma o de las proteínas del virus: que la reacción sea positiva no implica que el virus esté activo y sea infectivo. Es decir, podemos detectar su genoma o sus proteínas pero que el virus no esté completo, es decir, podemos estar detectando “restos” del virus. 

Detectar anticuerpos frente al virus: test serológicos

La tercera aproximación consiste en detectar la respuesta inmune frente al virus, los anticuerpos. Es una detección indirecta, no detectamos el virus sino que ponemos de manifiesto la respuesta inmune frente a él. En este caso la muestra que vamos a emplear es una gota de sangre, porque vamos a detectar los anticuerpos que has generado contra el virus.

De nuevo, hay distintas técnicas o soportes sobre los que hacer este tipo de test, pero más o menos todos tienen el mismo fundamento. En este caso, sobre el soporte se fijan proteínas del virus, normalmente las proteínas más expuestas hacia el exterior, como la proteína S de la envoltura. Esto es así porque nuestro sistema inmune lo primero que reconoce es lo que está más hacia el exterior del virus. Como con este test queremos detectar los anticuerpos que producimos, la muestra será una simple gota de sangre. Si en la muestra hay anticuerpos contra el virus, se pegarán y quedarán fijados a las proteínas del virus. A continuación, se añade un segundo anticuerpo contra el anticuerpo humano: estos suelen ser anticuerpos de otro animal que reaccionan contra nuestros propios anticuerpos, porque los anticuerpos humanos en realidad actúan como antígenos en otros animales. Se forma así un trío: proteínas del virus-anticuerpo humano-anticuerpo de otro animal. Este segundo anticuerpo estará marcado o señalado de alguna manera para poner de manifiesto la reacción.

Si la reacción es positiva, demuestra que había anticuerpos contra el virus, es decir, que la persona en algún momento ha estado en contacto con el virus y su sistema inmune ha reaccionado produciendo anticuerpos. Esto no implica necesariamente que esté infectado, quizá se ha curado, o simplemente ha estado en contacto con el virus y no ha tenido síntomas.

Este tipo de test también se ha desarrollado después que los de RT-PCR, cuando ya hemos tenido suero de pacientes que han pasado la enfermedad. También, tienen la ventaja de que son mucho más rápidos que la PCR, y según el tipo de soporte, se pueden realizar en menos de pocos minutos. No necesitan un equipamiento especifico ni un personal técnico altamente cualificado. Son más baratos. La desventaja es que son mucho menos específicos que la RT-PCR. Otra importante desventaja de este tipo de test es que nuestro organismo necesita varios días para  producir anticuerpos detectables. O sea, que una persona puede estar infectada pero durante los primeros días no dar positivo en este tipo de test.

Algunos test de anticuerpos pueden distinguir el tipo de inmunoglobulina: si es IgM, indicativo de una infección reciente, o IgG, indicativo de una respuesta secundaria, y por tanto, más prolongada.

Sensibilidad y especificidad

Cuando queremos estudiar el rendimiento o lo efectivo que es un test diagnóstico lo que hacemos es comparar el resultado de ese test en un grupo control de individuos que sabemos a ciencia cierta que están sanos o están infectados. Esto normalmente se hace comparando nuestro test con otro que se considera el patrón de referencia (gold standard). Con estos resultados se construye la tabla que nos muestra la distribución de sanos y enfermos y el resultado del test.

Así, podemos clasificar los pacientes como verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos (no están infectados pero el test es positivo) y falsos negativos (están infectados pero el test es negativo). Con estos datos podremos calcular la sensibilidad y la especificidad de nuestro test.

La sensibilidad del test representa la probabilidad de clasificar correctamente a los infectados o, lo que es lo mismo, a los verdaderos positivos. Una sensibilidad alta significa pocos falsos negativos. Es una proporción en la que en el denominador se sitúa el total de infectados y en el numerador los positivos verdaderos:

Sensibilidad = verdaderos positivos / total de infectados

Por su parte, la especificidad de un test representa la probabilidad de clasificar correctamente a los sanos o, lo que es lo mismo, a los verdaderos negativos. Una especificidad alta significa pocos falsos positivos. Es una proporción en la que en el denominador figuran el total de sanos y en el numerador los negativos verdaderos:

Especificidad = verdaderos negativos / total de sanos

Para entenderlo mejor, vamos a poner un ejemplo. Supongamos que tenemos una población de 100 individuos y queremos valorar la utilidad de la RT-PCR para el diagnóstico de la enfermedad por el coronavirus. En este caso seleccionamos el historial clínico (analítica, radiografías, etc.) como el patrón de referencia (asumiendo que esos datos no fallan nunca a la hora de clasificar sanos y enfermos y diagnosticar la COVID-19) y realizamos la RT-PCR a los 100 individuos. Los datos clínicos nos indican que 30 de los 100 tienen la enfermedad de COVID-19: hay 70 sanos y 30 enfermos. 

Al realizar la RT-PCR a las 100 individuos podríamos obtener los siguientes resultados (insisto que es un ejemplo ficticio):

Según esto, la sensibilidad de nuestro test de RT-PCR es del 93% (28/30) y la especificidad del 96% (67/70).

Uno de los problemas de estos parámetros es que la sensibilidad nos dice la probabilidad de clasificar correctamente al enfermo una vez que sabemos que está enfermo. Por su parte, la especificidad nos dice la probabilidad de clasificar correctamente al sano pero una vez que ya conocemos que está sano. Pero esto en la práctica, muchas veces, lo desconocemos. Cuando un test diagnóstico tiene tanto la sensibilidad como la especificidad cercanas al 100% se comporta como un test de referencia y por lo tanto sus resultados serán casi siempre válidos. Sin embargo, esta circunstancia es excepcional, muy pocas veces un test es 100% sensible y específico. La sensibilidad de la RT-PCR suele ser alta, alrededor de un 95%, y la de los test serológicos de un 70%. Por eso, se suelen emplear varios test diagnósticos al mismo tiempo, porque nos darán más información de la situación real.

Un pregunta que nos podemos hacer es ¿por qué a veces los test dan resultados falsos? Las causas son múltiples. Los falsos negativos pueden ser debidos: en el caso de la RT-PCR, a que la cantidad de virus o de muestra sea escasa, la liberación de los mismos sea intermitente, no se haya tomado bien la muestra, que no se haya extraído correctamente el genoma del virus, fallo en los reactivos o inhibición de la reacción; en el caso de los test serológicos, que la muestra se haya obtenido durante el periodo ventana en el que todavía no se hayan producido los anticuerpos, fallos en los reactivos del test, o baja sensibilidad.

Los falsos positivos pueden ser debidos: en el caso de la RT-PCR, a contaminación en el procesamiento de las muestras o reacción cruzada con otros virus, incluso fallo en el etiquetado; en el caso de los test serológicos, reacción a otros virus. 

¿Qué información nos puede dar la combinación de la RT-PCR y la detección de anticuerpos?

El test de RT-PCR nos indica la presencia del virus, quién está infectado en ese momento. Los test de detección de anticuerpos nos indican quién estuvo infectado y quizá está inmunizado, al menos durante un tiempo, contra el coronavirus. Según esto, y con todas las reservas según la sensibilidad y especificidad de cada test, si combinamos resultados de RT-PCR, con detección de anticuerpos (IgM e IgG) se podría plantear lo siguiente:

Sin embargo, este planteamiento es una simplificación y tiene sus limitaciones. El que no detectes anticuerpos puede no significar que no estés inmunizado. En el caso de infecciones por virus, que son intracelulares, la inmunidad celular no mediada por anticuerpos es tan importante o más que la mediada por anticuerpos. Es decir, en ocasiones, no hay anticuerpos pero el individuo puede estar “inmunizado”.

A pesar de ello, todo esto nos puede ayudar a controlar y monitorizar la epidemia en las próximas semanas, conocer cuántas personas han estado en contacto con el virus y están inmunizadas, a definir con mayor exactitud las tasas de letalidad del virus, predecir que podrá ocurrir si hay una segunda «oleada» del virus y a decidir las medidas y la velocidad del desconfinamiento que todos estamos deseando.

NOTA: 

Otro anticuerpo que tiene un papel predominante en las secreciones mucosas, como la respiratoria, es la IgA. En este sentido ya existen test para detectar IgA que parecen tener una mayor sensibilidad que los test para IgM o IgG.

Actualización (19/04/2020):

Para aclarar algunas preguntas, adjunto algunas tablas y diagramas sobre posible interpretación de resultados de la RT-PCR, y anticuerpos IgM, IgG. Os recuerdo que siempre habrá que tener en cuenta también los datos clínicos y que, ante la duda, los test se deberían repetir para confirmar.

Evolución de la concentración de ARN, IgM e IgG 

a lo largo de la enfermedad:

Protocolo de diagnóstico de la COVID19 (Fuente @Salud_JCYL):

Interpretación de los resultados de la PCR y anticuerpos:

Interpretación de las pruebas diagnósticas frente las SARS-CoV-2 (Ministerio de Sanidad)

AVISO: este blog es de divulgación científica, su objetivo es la difusión de la ciencia, no es un consultorio clínico. Yo no soy sanitario. Las consultas particulares sobre temas clínicos deben hacerse al médico. Las consultas sobre los resultados particulares de las pruebas de diagnóstico y sobre cómo interpretarlos deben hacerse al médico o al servicio que te las haya hecho. 

Son decenas
de miles los artículos científicos publicados sobre el empleo de esta técnica
para detectar patógenos microbianos. Pero la reacción de PCR también tiene
algunas limitaciones: emplea componentes enzimáticos muy sensibles que
requieren una cuidadosa purificación de los ácidos nucleicos (ADN o ARN) de la
bacteria, y sofisticados y caros termocicladores. Además, la técnica requiere ciertas
habilidades por parte del personal. Por eso, sigue siendo un reto el
desarrollar tecnologías sencillas y baratas que permitan un diagnóstico rápido
y preciso.

Un
grupo de investigadores canadienses han desarrollado un pequeño dispositivo que
combina un sistema para romper y lisar las bacterias con un biosensor
electroquímico ultrasensible capaz de detectar la bacteria. 

El chip
incluye un biosensor que contiene unas sondas (monocadenas de ADN específicas)
que al unirse o hibridarse con el ADN complementario de la bacteria generan una
respuesta electrocatalítica que se traduce una señal eléctrica detectable.

El
sistema integra en un único dispositivo todo lo necesario. Primero se introduce
a través de una jeringa en una cámara de
lisis la muestra problema, que contiene las bacterias.  Se aplica una descarga eléctrica capaz de
romper y lisar las bacterias, lo que libera sus ácidos nucleicos. La muestra
pasa al chip de detección que
consiste en unos microelectródos que detectan secuencias de ácidos nucleicos
específicas que se unen a sondas moleculares inmovilizadas en el sensor. Esta
reacción de hibridación genera una señal eléctrica fácilmente detectable en el
sensor. El proceso se completa en menos
de 30 minutos.

El chip
lo han validado con muestras de Escherichia coli (una bacteria
Gram-negativa) y de Staphylococcus (Gram-positiva y más resistente a la lisis).
Comprobaron que la descarga eléctrica era capaz de romper ambas bacterias y
liberar sus ácidos nucleicos. Y mediante hibridación con sondas específicas
detectaron cantidades tan pequeñas como 1 bacteria por microlitro! También lo
ensayaron con muestras de orina contaminadas con las mismas bacterias.  

Es el
primer sistema de detección “PCR-free” basado en un chip que incluye una cámara
de lisis acoplada a un microsensor ultrasensible.  Todos los componentes del sistema son muy
baratos y están integrados en un solo dispositivo muy fácil de usar.

Aunque
es necesario realizar más pruebas con diferentes tipos de microorganismos, a
distintas concentraciones y en muestras biológicas reales, no cabe duda que
este nuevo chip  “prodigioso” puede ser
el comienzo de una nueva revolución en la detección de microbios patógenos,
como lo fue en su día la PCR: la “vieja” PCR que quizá ahora pase ya a los
libros de historia!

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Lam, B., et al. (2012). Polymerase Chain Reaction-Free, Sample-to-Answer Bacterial Detection in 30 Minutes with Integrated Cell Lysis Analytical Chemistry, 84 (1), 21-25 DOI: 10.1021/ac202599b

En 1928 Alexander Fleming observó que un hongo (Penicillium) que creció accidentalmente sobre unas placas de
cultivo con la bacteria Staphylococcus,
creaba un círculo libre de bacterias alrededor suya. Descubrió así una
sustancia producida por el hongo capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, a
la que denominó penicilina, el primer antibiótico.

Los microbios son capaces de producir
y secretar compuestos químicos naturales con múltiples efectos sobre otros
seres vivos. Gran parte de la industria farmacéutica se ha basado sobre eldesarrollo de estas pequeñas moléculas
naturales producidas por bacterias y hongos. Descubrir nuevas moléculas con
actividad interesante es un trabajo inmenso que requiere mucho tiempo de
dedicación e inversión. Desde el punto de vista económico a veces no es
rentable y esto hace que algunas empresas farmacéuticas hayan dejado de
investigar y producir nuevos antibióticos, por ejemplo.

Las bacterias y muchos hongos crecen
sobre la superficie de agar

de los medios de cultivo formando agrupaciones de microorganismos

o colonias (Fuente).

Un grupo de investigadores han desarrollado
una novedosa tecnología rápida y de alta sensibilidad que  puede revolucionar la manera de buscar nuevos
productos químicos de origen microbiano. Para ello, analizan directamente sobre
las colonias bacterianas las moléculas secretadas mediante técnicas de espectroscopia de masas, pudiendo así
identificarlas y caracterizarlas.

La técnica se basa en un sistema de
espectroscopia de masas denominad nanoDESI (nanospray
desorption electrospray ionization) que se
combina con la construcción de redes moleculares para la identificación de los
compuestos. Mediante un capilar se añade un solvente directamente sobre cualquier
superficie de estudio. Otro capilar recoge las moléculas liberadas que son
enviadas al espectrómetro de masas para su análisis.

Han aplicado esta técnica sobre la
superficie de colonias de bacterias vivas creciendo sobre una placa de Petri,
sin necesidad de manipular o preparar la muestra. De esta forma han analizado
la producción de compuestos químicos a partir de colonias bacterianas de
distintos tipos, como Bacillus subtilis,
Streptomyces coelicolor, Mycobacterium smegmatis y Pseudomonas aeruginosa. Han encontrado una
increíble diversidad de moléculas, que sobrepasa por mucho nuestra actual
visión del metabolismo bacteriano secundario.

Por ejemplo, mediante el análisis de
los compuestos producidos por una sola colonia de Bacillus subtilis a distintos tiempos, han sido capaces de observar
la activación y supresión temporal de compuestos concretos del metabolismo de
la bacteria. Aunque muchas de las moléculas detectadas ya se conocían, otras
son completamente nuevas o son variantes estructurales de compuestos ya
conocidos. La cantidad de compuestos
químico que una bacteria es capaz de producir es muchísimo mayor de los que se
creía, mucho más compleja y más sofisticada, lo que demuestra la enorme
plasticidad biosintética de las bacterias.

Se han secuenciado ya muchos genomas
bacterianos, pero no conocemos la función de la mayoría de sus genes. Mediante
esta técnica se podrían relacionar determinados genes con funciones metabólicas
concretas. Además, permitirá descubrir de manera mucho más rápida y barata
nuevos compuestos químicos de origen microbiano que podrán revolucionar la
industria farmacéutica, como en su día ocurrió gracias a la observación casual
de Fleming.

Mass spectral molecular networking of living microbial
colonies. Watrous J, et
al. ProcNatlAcadSci USA. 2012.
109(26):E1743-52.

doi: 10.1073/pnas.1203689109

Un grupo de ingenieros de UCLAhan desarrollado un sistema para la detección de
E. coli mediante un sensor basado en
un teléfono móvil (o celular, como se le conoce en muchos países) capaz de
captar señales fluorescentes. Para ello, los ingenieros han empleado unos anticuerpos
especiales que se unen a las células de E.
coli. Empleando unas sencillas lámparas tipo LED excitan a las células de E. coli que han sido retenidas en la
superficie de un sistema de capilares. La fluorescencia que emiten es captada
por la cámara del teléfono móvil al que se le ha acoplado una lente especial.

Así, el teléfono actúa como un
microscopio de fluorescencia capaz de captar luz. De esta forma, los
investigadores han podido detectar E.
coli en muestras de agua y de leche desnatada. Además, como la intensidad
de la señal es proporcional a la concentración de bacterias, este sistema es
cuantitativo, es decir permite determinar la concentración de bacterias en la
muestra. Los investigadores fueron capaces de detectar cantidades tan pequeñas
como 5-10 bacterias por mililitro de muestra. Han empleado la cepa 0157:H7, una variedad de E. coli enterohemorrágica que produce
una toxina que puede provocar diarrea grave y daño renal, y cuya dosis
infectiva es de tan solo 10-100 bacterias. Además, demostraron que el sistema
de detección era específico, puesto que cuando emplearon muestras con células
de Salmonella, no obtuvieron señal
alguna. Por tanto, colocando una pequeña muestra de agua en los capilares
asociados a este sistema, se puede detectar la presencia de E. coli en muestras de agua de forma
sencilla e inmediata. Esto puede suponer un gran avance para el control de este
patógeno en zonas donde los recursos son limitados.

El sistema emplea un
móvil Sony-Erickson con una cámara de 8 megapixels. Se calcula que existen en
el planeta más de 5 mil millones de teléfonos móviles, y más del 70% de ellos
en los países en vías de desarrollo.

Este sistema de detección
asociado al teléfono móvil es una solución compacta, ligera, portátil y barata
que podría aplicarse para otros patógenos de interés empleando distintos
anticuerpos específicos.

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te gustará Un sueño hecho realidad: diagnosticar enfermedades infecciosas en mitad de la sabana africana por unos céntimos de Euro en unos pocos minutos, sobre el desarrollo de un microchip,
del tamaño de una tarjeta de crédito, capaz de detectar anticuerpos contra HIV
y Treponema pallidum, y diagnosticar
así el SIDA y la sífilis, respectivamente.

Quantum
dot enabled detection of Escherichia coli
using a cell-phone. Zhu, H., et al. Analyst, 2012, Advance Article

doi: 10.1039/C2AN35071H

Expertos en bioingeniería de la Universidad de Columbia han desarrollado un revolucionario microchip, del tamaño de una tarjeta de crédito, capaz de detectar anticuerpos contra HIV y Treponema pallidum, y diagnosticar así el SIDA y la sífilis, respectivamente. Este chip tienen un rendimiento similar al de otras técnicas comerciales, pero su coste y sencillez es muy superior. La fabricación de cada chip puede ser inferior a 0,1 dólares y se pueden producir uno cada 40 segundos. Para detectar la señal se emplea un dispositivo muy simple cuyo coste no supera los 6 dólares y tan sencillo de usar como un teléfono móvil. La interpretación de los resultados, por tanto, es también muy sencilla.

[Vídeo explicativo]

El chip se basa en tecnología de microfluídos y nanopartículas y permite realizar complejos ensayos de laboratorio en un solo dispositivo. La detección se basa en un inmunoensayo similar a la técnica de ELISA, pero este chip permite realizar el ensayo en menos de 15 minutos, con un equipo mínimo y empleando solo un microlitro (0,001 mililitro!) de muestra de sangre del paciente, que puede obtenerse con un simple pinchazo en el dedo. Funciona perfectamente con sangre, plasma o suero. Por su facilidad de uso y su reducido coste puede ser empleado en las regiones más remotas del mundo, por personal no cualificado y sin recursos. No es necesario realizar el ensayo en un laboratorio, no necesita corriente eléctrica, es estable por mas de 6 meses a temperatura ambiente, es un sistema portátil que puede ser empleado en pruebas “de campo”, lo que permite el diagnóstico inmediato sin necesidad de que el paciente se traslada al hospital. Se ha ensayado ya con éxito, por ejemplo, en una campaña en Rwanda.

Este novedoso trabajo, publicado en Nature Medicine, supone un nuevo hito de la bioingeniería que posibilita realmente hacer accesibles a todas las personas el diagnostico de enfermedades infecciosas.

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