Robert Koch fue
el primero que cultivó bacterias en medios sólidos. Primero empleó rebanadas de patata, pero se le
contaminaban fácilmente con hongos ambientales. Luego empleó gelatina para solidificar los medios,
pero algunos microorganismos son capaces de degradarla, se la comen. Además, la
gelatina no se mantenía sólida a 37ºC, que es la temperatura a la que crecen la
mayoría de los patógenos humanos. La idea de emplear agar la sugirió Angelina Fanny Eilshemius, la mujer de Walter Hesse, unos de los colaboradores
de Koch. Angelina Fanny empleaba agar para solidificar las mermeladas y Walter se
llevó el invento de la cocina al laboratorio y fue el primero que empleó agar
en lugar de gelatina. La ventaja del agar
es que permanece sólido a 37ºC, la mayoría de las bacterias no la degradan y
además es trasparente, lo que facilita el examen de las colonias bacterianas.
Llevamos más de 120 años usando el agar para preparar los medios y obtener
cultivos puros bacterianos. Algo tan sencillo como los medios sólidos con agar
en placas de Petri ha sido esencial para el desarrollo de la microbiología
clínica y de estrategias para combatir las bacterias patógenas.

Sin embargo, desde el comienzo de la microbiología sabemos
que existen muchos microorganismos que no crecen en los medios que les
preparamos en el laboratorio y no los podemos cultivar. Las nuevas técnicas de
secuenciación masiva han puesto de manifiesto la existencia de una enorme
cantidad de microorganismos no
cultivables, lo que se conoce como la
materia oscura del universo microbiano (sobre este tema te puede interesar
esta otra entrada de microBIO).

Ahora un grupo de investigadores japoneses han descubierto
que la preparación de los medios de
cultivo con agar, que llevamos haciendo desde los tiempos de Koch, puede inhibir el crecimiento de muchas
bacterias. En realidad es un hecho conocido que el número total de células
en un cultivo no suele coincidir con las que se cuentan sobre una placa de
Petri, pero hasta ahora no sabíamos la razón. Estos autores han descubierto que
cuando se autoclavan juntos el fosfato y el agar para preparar un medio sólido,
la cantidad de colonias bacterianas totales que se obtiene es 50 veces menor
que cuando se autoclavan de forma separada. Autoclavar juntos el agar y el fosfato genera compuestos tóxicos que
inhiben el crecimiento bacteriano. El análisis químico sugiere que esta
inhibición del crecimiento es debida a la producción de peróxido de hidrógeno (H₂O₂), un agente
oxidante tóxico.

Colonias de bacterias y hongos sobre una placa de Petri.

Además, secuenciaron un total de 6.528 colonias bacterias
que crecían en los distintos medios. Comprobaron que en los medios con el fosfato autoclavado por separado había más de un
30% de géneros bacterianos clasificados como “no cultivables” que no
crecían en los medios con fosfato y agar autoclavados juntos. Han comparado también
los resultados de la secuenciación masiva de muestras ambientales con el
cultivo. Como cabía esperar, observaron que la secuenciación revelaba muchos
más grupos bacterianos que el cultivo: por ejemplo, mediante secuenciación
directa fueron capaces de detectar 53 grupos bacterianos en muestras de suelo,
pero solo 6 fueron capaces de crecer en los medios de cultivo. Esto confirma la
idea de que la mayoría de los
microorganismos ambientales son no cultivables.

Comparación de la proporción
relativa de phyla aislados de
distintas muestra ambientales (río, sedimento o suelo) crecidas en distintos
medios de cultivo o mediante secuenciación directa del ADN total. En los medios
PS o PW había más de un 30% de géneros bacterianos clasificados como “no
cultivables” que no crecían en el medio PT. La secuenciación (454) revelaba
muchos más grupos bacterianos que los cultivos. PT, medio con fosfato y agar
autoclavados juntos. PS, medio con fosfato y agar autoclavados por separado. PW,
medio sin fosfato. 454, pirosecuenciación directa (ver ref. 1).

Aunque ya se sabía que autoclavar juntos azúcares y fosfato
o glucosa y proteínas puede generar componentes tóxicos que inhiben el
crecimiento bacteriano, es la primera vez que se demuestra que autoclavar
juntos el fosfato y el agar puede ser responsable de inhibir el crecimiento de
muchas bacterias, que hasta ahora han sido clasificadas como “no cultivables”.

En tu próximo experimento haz la prueba, prepara el medio
autoclavando por separado el agar y el fosfato, a ver qué pasa!

(1) A hidden pitfall in the preparation of agar media
undermines microorganism cultivability. Tanaka T, et al. Appl Environ
Microbiol. 2014. 80(24):7659-7666.

doi: 10.1128/AEM.02741-14

En astrofísica
se denomina materia oscura a la
materia que no emite radiación electromagnética y no podemos detectarla, pero
cuya existencia se puede deducir: está ahí fuera pero no la podemos detectar.
Algo parecido ocurre con el mundo microbiano. Los microbios son las formas de
vida más diversas y abundantes del planeta, y pueden ocupar cualquier nicho
metabólico. Hasta hace unos pocos años solo conocíamos los microbios que
podíamos cultivar y crecer en el laboratorio, y algunos incluso verlos al
microscopio. Pero sabemos que existen muchos otros que no somos capaces de
cultivarlos, que están ahí fuera pero no sabemos nada de ellos, o casi nada. La
inmensa mayoría de los microbios que existen en la naturaleza no se han
obtenido en cultivo puro en el laboratorio: son los microorganismos no cultivables. Las técnicas de amplificación,
secuenciación y detección de genomas independientes del cultivo microbiano está
poniendo de manifiesto la existencia de muchos de ellos: la materia oscura del
universo microbiano.

Conforme vamos obteniendo mas datos, el número de especies
de microorganismos va aumentado y ya se estima que puede haber millones de especies distintas. Se
clasifican en al menos 60 líneas o grupos de descendencia (phyla o divisiones) en dos dominios: Bacteria y Archaea. La
mitad de estas divisiones no tienen representantes cultivables. El 88% de todos
los aislamientos microbianos que cultivamos en el laboratorio pertenecen solo a
cuatro grupos: Proteobacteria,
Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes.
La inmensa mayoría de la diversidad microbiana por tanto está sin explorar,
sencillamente porque no podemos cultivarlos.

Se ha publicado en Nature un pionero estudio sobre la
detección y análisis de secuencias de genomas de microbios no cultivables. Lo
original de este trabajo ha sido la aplicación de una nueva tecnología que
consiste en la amplificación y secuenciación
del DNA de células individuales (single-cell genomics) obtenidas
directamente de muestras ambientales y sin necesidad de cultivarlas.

Las muestras se han obtenido de nueve hábitats distintos: un
lago en Canadá, una laguna en Grecia, las profundidades del océano Atlántico, la
costa de Hawaii, una mina de oro abandonada en Dakota del Sur o sedimentos de
un manantial de agua caliente en Nevada. A partir de estas muestras, se aislaron
9.600 células individuales de las que extrajeron su DNA, amplificaron el genoma
y lo secuenciaron. Identificaron así 201
genomas distintos de 29 grupos no cultivables ni explorados nunca antes del
árbol de la vida (21 de Bacteria y 8
de Archaea). El análisis de los datos
ha permitido descubrir nuevos rasgos o características microbianas, nuevas capacidades
metabólicas como nuevos factores de iniciación de la transcripción en Archaea o nuevos codones de terminación,
y proponer dos nuevos superphyla en la clasificación de
las bacterias. Además, se han encontrado en el genoma de algunas bacterias genes
que normalmente se encuentran en algunos tipos de hongos mucosos, lo que
sugiere que ha existido una transferencia
lateral de genes entre eucariotas y Archaea,
algo que hasta ahora no se conocía.

Y esto solo es un primer paso, el comienzo de lo que puede
ser una nueva era de la microbiología: nos empezamos a asomar a la materia
oscura del universo microbiano. Apasionante!

Otras entradas en microBIO
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– El árbol que plantó Carl R. Woese

– J. C. Venter versus J. Verne: biodiversidad y diez mil leguas de viaje submarino

Rinke, C. S., et al. (2013). Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature, 499 (7459), 431-437 DOI: 10.1038/nature12352.